\(\text{Comptes Rendus Biologies 343 (2020) 101-110.}\)
\(\text{Omar El Hiba ; Ahmed Draoui ; Halima Gamrani}\)
La Dehydroépiandrostérone sulfate (DHEAS) exerce des fonctions importantes dans le système nerveux central comme la modulation de la mort neuronale, le développement du cerveau, la cognition et le comportement. Cependant, très peu est connu concernant l’interaction de cette stéroïde avec les cellules gliales, en particulier celles formant les organes circumventriculaires (CVOs). La présente étude, d’une part, s’est focalisée sur l’évaluation du possible effet de la DHEAS sur l’organe sous commissural (SCO) chez le rat connu en tant qu’un des CVOs. L’organe sous commissural peut libérer une glycoprotéine de grand poids moléculaire nommée fibre de Reissner (RF) dans le liquide céphalorachidien (CSF) ; une activité sécrétoire remarquable. D’autre part, nous avons examiné l’innervation sérotoninérgique du noyau de Raphé dorsal (DRN) et l’éventuelle innervation du SCO. Nos données ont révélé une élévation significative de l’immunoréactivité à la RF dans le SCO après une seule injection i.p de la DHEAS à une dose de 5mg/kg B.W. une réduction de sérotonine (5-HT) dans le DRN et les fibres atteignant le SCO a été aussi observée. Les présentes données ont apporté une évidence d’un possible potentiel modulateur des neurostéroïdes, en particulier la DHEAS sur l’activité sécrétoire du SCO. Cette étude pourra ouvrir une nouvelle fenêtre pour une meilleure compréhension du rôle et de l’interaction des neurostéroïdes avec un des organes circumventriculaires les plus importants du cerveau des mammifères.
Le concept de neurostéroïdes a été attribué concernant l'origine de la synthèse ou de la production. Ces molécules sont reconnues comme modulateurs des activités neuronales et classées en deux types: les stéroïdes exogènes (synthétiques) et endogènes. Ce dernier est subdivisé en type hormonal (produit par les glandes endocrines) et neurostéroïdes (produit par le tissu nerveux) [ 1 ], en particulier dans les cellules neuronales et gliales [ 2 ]. Des travaux antérieurs ont montré que le neurostéroïde neuroactif déhydroépiandrostérone (DHEA) est présent dans le tissu cérébral indépendamment de son origine périphérique [ 3 ]. Les enzymes nécessaires à la biosynthèse de la DHEA ont également été trouvées dans le cerveau [ 4 , 5 ], à la fois dans les astrocytes [ 6 ,7 ] et les neurones [ 8 , 9 ]. De plus, la DHEA et son ester sulfate (DHEAS) pourraient exercer des fonctions importantes dans le système nerveux telles que la modulation de la mort et de la survie neuronales [ 10 , 11 , 12 ], le développement cérébral [ 13 ], la cognition [ 14 , 15 ] et le comportement [ 16 , 17 , 18 ]. Les effets de la DHEA et de la DHEAS sur le système nerveux sont en partie médiés par la modulation de plusieurs systèmes de neurotransmetteurs, tels que le dopaminergique [ 19 , 20 , 21 ], le glutamatergique [ 11, 22 ] systèmes sérotoninergiques [ 19 , 23 ] et GABAergiques [ 24 , 25 ]. Sur la base de la littérature, nos connaissances sur les effets des neurostéroïdes sur les cellules gliales sont encore très faibles, même sur celles constituant les organes circonventriculaires, en particulier l'organe sous-commissural (SCO). Ce dernier est connu comme un organe sécrétoire situé à l'entrée de l'aqueduc cérébral sous la commissure postérieure. Cette glande cérébrale libère des glycoprotéines de poids moléculaire élevé dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) où elles s'agrègent pour former la fibre de Reissner (RF) [ 26 ]. Plusieurs rôles ont été proposés pour cette glande comme l'homéostasie de l'eau [ 27 , 28], survie neuronale [ 29 ], détoxification [ 30 ], clairance des monoamines dans le LCR [ 31 ], lordose [ 32 ], dans la physiopathologie de l'hydrocéphalie [ 33 ] et éventuellement de l'encéphalopathie hépatique [ 34 ]. Des travaux antérieurs ont montré que le SCO reçoit plusieurs innervations neuronales de nature GABAergique [ 35 , 36 ], noradrénergique et dopaminergique [ 27 ] et sérotoninergique [ 28 , 34 , 37 ]. Ce dernier est le système le plus influent sur l'activité sécrétoire du SCO chez différentes espèces de mammifères [ 34 , 38, 39 , 40 , 41 ]. Ainsi, nous avons cherché, tout au long de la présente enquête, à tester les effets modulateurs possibles du neurostéroïde DHEAS sur l'activité sécrétoire du SCO chez le rat normal, ainsi que l'évaluation de l'expression de la sérotonine dans le noyau du raphé dorsal et les fibres innervantes atteignant le SCO dans les mêmes conditions expérimentales, au moyen d'une approche immunohistochimique.
Toutes les expériences ont été réalisées chez le rat Sprague Dewley mâle adulte logé à température ambiante constante (25 ° C), avec un cycle de lumière obscure de 12 h avec libre accès à la nourriture dans tous les groupes étudiés. Les rats ont été traités conformément aux directives de l'Université Cadi Ayyad, Marrakech (Maroc). Toutes les procédures étaient conformes au décret européen, relatif à l'évaluation éthique et à l'autorisation de projets utilisant des animaux pour des procédures expérimentales, 1er février 2013, NOR: AGRG1238767A. Ainsi, tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d'animaux et la souffrance.
Les animaux ont été divisés en 2 groupes: le premier des témoins salins ( n = 5) avec une seule injection de tampon physiologique salin (NaCl 0,9%. Ip), tandis que dans l'autre groupe ( n = 5) les rats ont été soumis à une seule injection. injection intrapéritonéale avec le neurostéroïde DHEAS (5 mg / kg de poids corporel) acheté auprès de Sigma (Oakville, ON, Canada). Les expériences ont été faites le matin entre 10 h et 12 h.
30 min après l'injection, suffisamment pour que la DHEAS franchisse la barrière hémato-encéphalique et induise ses effets centraux [ 42 ], les rats de chaque groupe ont été anesthésiés par voie intrapéritonéale avec du pentobarbital sodique (40 mg / kg. Ip) et perfusés par voie transcardiaque avec une solution saline physiologique réfrigérée et du paraformaldéhyde. (4%) dans du tampon phosphate (PBS, 0,1 M, pH 7,4). Les cerveaux ont été post-fixés dans la même nuit de four fixatif à 4 ° C, déshydratés dans des solutions d'éthanol graduées (50 à 100%), passés à travers des solutions de polyéthylène glycol (PEG) en série et incorporés dans du PEG pur. Coupes frontales (20 ?m) ont été coupés avec un microtome, collectés et rincés dans du PBS pour laver le fixateur. Des coupes ont été réalisées dans tout le SCO et le noyau du raphé dorsal (DRN) et un immunomarquage a été réalisé sur six coupes sélectionnées. Les coupes flottantes libres ont été incubées dans des anticorps RF 5-HT ou polyclonaux [ 29] respectivement, dilué au 1/1000 dans du PBS contenant 0,3% de Triton X-100 et 1% de sérum albumine bovine. Après trois lavages dans le même tampon, les coupes ont été incubées pendant 2 h à température ambiante dans des immunoglobulines de chèvre anti-lapin biotinylées (1/1000, Dako, Copenhague, Danemark) puis, après lavage, incubées dans de la streptavidine peroxydase (1/2000; Dako, Copenhague, Danemark). L'activité de la peroxydase a été révélée en incubant des coupes dans 0,03% de DAB (3-3-diaminobenzidine, Sigma, Oakville, Canada) dans un tampon Tris 0,05 M, pH 7,5, contenant 0,01% H 2 O 2. Les coupes ont ensuite été collectées, déshydratées et montées dans Eukit pour une observation en microscopie optique. La spécificité des matériaux immunoréactifs a été testée suite à la soumission des lames au même protocole immunohistochimique décrit ci-dessus soit en utilisant le sérum préimmun soit en omettant les anticorps primaires. Ces tests ont montré que les anticorps primaires utilisés contre les RF et la 5-HT présentent un marquage spécifique [ 34 ]. La quantification des matériaux immunoréactifs a été réalisée selon le protocole publié par Vilaplana et Lavialle 1999 [ 43]. En bref, la numérisation et le stockage des images ont été réalisés à l'aide d'un microscope Zeiss-Axioskop 40 équipé d'un appareil photo numérique Canon. Les images ont été numérisées en 512/512 pixels avec huit bits de résolution de gris et ont été stockées au format TIFF. Le traitement et la quantification des images ont été effectués à l'aide d'Adobe Photoshop v.6.0. Après transformation de chaque image en mode binaire, les pourcentages de pixels noirs ont été obtenus à l'aide de l'option d'histogramme d'image d'Adobe Photoshops. Ce pourcentage correspond aux zones immunopositives des fibres de Reissner dans tout le SCO, y compris les parties apicale et basale ou la zone immunoréactive 5-HT dans la partie basale entourant le SCO ou la partie médiane du noyau du raphé et les fibres s'étendant à l'extérieur de l'organe. Cinq sections de témoins salins et de rats DHEAS ont été choisies au hasard pour la quantification. La spécificité des matériaux immunoréactifs a été testée après soumission des lames à la même procédure immunohistochimique que celle décrite ci-dessus et en utilisant le sérum pré-immun ou en omettant les anticorps primaires. Ces tests ont montré que les anticorps primaires utilisés contre la 5-HT et la RF affichent un marquage spécifique comme cela a été publié précédemment [28, 34].
Les données sont exprimées en moyenne ± SEM et ont été soumises au test de Student T. Une valeur de P <0,05 a été considérée comme indiquant une signification statistique entre les témoins et le groupe DHEAS. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel informatique SPSS 10.0 pour Windows® (IBM, Chicago, IL, USA).
Nous avons effectué une analyse immunohistochimique en utilisant un antisérum contre la fibre de Reissner dans les sections frontales de l'organe sous-commissural. Dans les contrôles salins, l'immunoréactivité RF est apparue très importante et s'étend à l'ensemble du SCO (figure 1 A). Le marquage a été observé sur les trois composants de SCO: les cellules épendymales, les cellules hypendymales et les extensions basales qui semblent sécréter activement avec RF-IR élevé dans les parties apicales de l'organe (Figure 1 A, a). Chez les rats DHEAS cependant, une augmentation globale et significative (figure 1 C, p <0,05) de l'immunoréactivité RF a été observée dans toutes les parties du SCO, en particulier les parties apicales de l'organe (figure 1 B, b).
Nous avons réalisé une évaluation immunohistochimique de l'innervation sérotoninergique, bien connue pour contrôler la libération de RF par les différents composants du SCO [ 34 , 39 , 41 ]. Chez les rats témoins salins, nous avons observé un plexus dense et continu de fibres 5-HT-immunoréactives autour de l'ensemble du SCO (figure 2 A). Les fibres immunoréactives 5-HT ont été organisées principalement sur des fibres de sérotonine perpendiculaires et parfois parallèles atteignant les épendymocytes et les cellules hypendymaires avec une condensation au niveau des parties latérales de l'organe (Figure 2 A, a). Chez les rats DHEAS, cependant, un (Figure 2 E, P<0,05) et une perte évidente de l'immunoréactivité 5-HT a été observée, en particulier dans les parties basales et latérales dans tout le SCO (Figure 2 B, b).
Pour évaluer si la perte de 5-HT dans les nerfs terminaux atteignant le SCO était liée à des événements survenus au sein du péricarya d'origine, nous avons effectué une enquête immunohistochimique du noyau d'origine, le noyau du raphé dorsal (DRN), qui innervait différents régions du cerveau, y compris le SCO [ 38 , 44 ]. Chez le rat DHEAS (Figure 2 D), nous avons observé une perte drastique d'immunocoloration dans toutes les régions du DRN par rapport aux témoins salins (Figure 2 C), correspondant à des quantités significativement diminuées (Figure E, P <0,05) de 5-HT dans le péricarya ainsi que dans le réseau dendritique de tout le noyau.
Le potentiel modulateur des neurostéroïdes, en particulier la déhydroépiandrostérone (DHEA) et son ester sulfate (DHEAS), sur de multiples systèmes neuronaux, a été principalement étudié sur les systèmes dopaminergique [ 20 , 21 ], glutamatergique [ 22 ] sérotoninergique [ 19 , 23 ] et GABAergique. [ 24 , 25 ]. Néanmoins, on sait peu de choses sur les réponses gliales aux neurostéroïdes, à l'exception de certaines découvertes qui ont étudié les effets des neurostéroïdes sur les astrocytes en particulier [ 45 , 46 ]. À travers la présente enquête, nous avons cherché à évaluer l'effet de in vivoadministration chez le rat de DHEAS à une dose de 5 mg / kg, lors de la libération de RF dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) par les épendymocytes SCO. Le SCO est une glande épendymaire située dans la région dorso-caudale du troisième ventricule, libérant des glycoprotéines de haut poids moléculaire appelées «fibre de Reissner» dans le liquide céphalo-rachidien [ 26 , 47 ]. Cette glande cérébrale particulière a été principalement décrite comme l'un des organes circonventriculaires (OVC) les plus reconnus dans le cerveau des mammifères [ 48 , 49 ]. Elle constitue une zone particulière d'une barrière hémato-encéphalique déficiente caractérisée par un manque de jonctions serrées entre les cellules endothéliales [ 49 ]. Par conséquent, il est hautement perméable aux molécules de poids moléculaire élevé et aux substances polaires [49 ]. De nombreuses fonctions ont été attribuées à cet organe particulier, impliqué dans différentes conditions physiopathologiques (voir introduction). Cependant, le mécanisme d'action impliquant cette glycoprotéine dans de telles fonctions est encore un sujet de débat. Après une seule injection avec le neurostéroïde neuroactif DHEAS (5 mg / kg) chez le rat, nous avons observé une immunoréactivité des fibres de Reissner sensiblement augmentée au sein des cellules hypendymales et épendymaires constituant respectivement les parties basale et apicale du SCO. Cela nous a conduit à suggérer une possible libération accrue de matériel de sécrétion dans le LCR et les vaisseaux sanguins [ 50]. À ce jour, la signification fonctionnelle d'un tel phénomène n'est pas encore établie, bien que nous spéculions un possible rôle régulateur RF des niveaux de monoamines et de leurs métabolites dans le LCR. Le soutien de ce point de vue est fourni par certaines preuves substantielles montrant que le complexe SCO-RF participe à l'élimination du LCR de certaines monoamines en les liant. Ainsi, la RF, in vitro ou in vivo, se lie à l'épinéphrine (EP), à la noradrénaline (NEP) et au 5HT [ 31 , 37 , 51 ]. L'hypothèse de liaison a également été soutenue par des études récentes de biologie moléculaire. Les glycoprotéines RF ont des séquences répétées [ 47 ] qui présentent une forte homologie avec un ou deux domaines de transporteurs de monoamine [52 ]. Ces domaines se lient et transportent le long du LCR certaines monoamines et métabolites tels que EP, NEP, dopamine (DA), 5-HT et L-DOPA [ 31 ]. De plus, les rats dépourvus de RF présentaient une concentration accrue dans le LCR de certaines monoamines et de leurs métabolites tels que la 5-HT, l'EP et l'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC) [ 53 ]. Ces données soutiennent en outre le rôle du SCO-RF dans la clairance des monoamines cérébrales atteignant le LCR. Sinon, des preuves considérables ont montré que la DHEAS et la DHEA provoquent des changements profonds dans le système monoaminergique. En effet, en présence des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2, la spipérone et le sulpiride, la DHEAS pourrait produire une facilitation marquée de la libération élevée de [3H] NEP provoquée par K + de manière dose-dépendante. De plus, Monnetet coll. [ 54 ] ont rapporté que DHEAS pourrait potentialiser la libération de [3H] NEP évoquée par NMDA à partir de coupes d'hippocampe. Il a été démontré que la DHEA et la DHEAS augmentent la libération de dopamine, mais dans des conditions expérimentales différentes. DHEAS (10 -7 -10 -8 M) augmente la libération de dopamine dans les cultures de cellules hypothalamiques [ 55 ] et les cellules PC12 [ 56 ]. La DHEA augmente également la libération de dopamine dans les cellules PC12, mais plus tôt que la DHEAS [ 56]. Par conséquent, la DHEA et la DHEAS augmentent la libération de dopamine, mais probablement par des mécanismes différents. Les résultats ci-dessus semblent soutenir notre point de vue selon lequel la RF est impliquée dans la régulation des niveaux de LCR éventuellement augmentés de certaines monoamines et de leurs métabolites se produisant dans le cerveau supplémenté avec DHEAS.
Une autre preuve qui peut en partie expliquer la montée des matériaux SCO-RF en présence de DHEAS (notre constatation) est que le SCO est une cible de nombreuses sorties neuronales, dont une de nature sérotoninergique [ 28 , 34 ]. En effet, nos résultats actuels ont apporté une preuve expérimentale d'une perte d'immunoréactivité 5-HT au sein des fibres sérotoninergiques innervant l'ensemble du SCO après l'administration de DHEAS (5 mg / kg de poids corporel). Ceci était concomitant avec un déficit au sein du noyau d'origine, le DRN. Sinon, des preuves substantielles suggèrent que le système sérotoninergique, qui provient du noyau du raphé dorsal (DRN), contrôle négativement l'activité sécrétoire SCO chez le rat [ 28 , 34 , 57]. Ces données sont en parfaite concordance avec nos résultats. Par conséquent, l'augmentation de la teneur en fibres de Reissner induite par la DHEAS dans le SCO semble être la conséquence éventuelle d'une régulation négative de la 5-HT par le neurostéroïde neuroactif DHEAS. En effet, plusieurs effets des neurostéroïdes sur le métabolisme de la sérotonine ont été élucidés dans différentes conditions expérimentales. En fait, dans l'hypothalamus de souris B6 nourries avec un régime supplémenté en DHEA (0,45% p / p) pendant 7 jours, les niveaux de 5-HT avaient tendance à diminuer avec son métabolite acide 5-hydroxyindolacétique (5-HIAA), suggérant une réduction de 5 Synthèse HT [ 23 ]. De plus, la DHEA (200 mg / kg, ip) augmente la teneur en 5-HIAA dans le mésencéphale et diminue les niveaux de 5-HT dans le cervelet [ 58]. À une dose de 25 mg / kg, il augmente également les taux de 5-HIAA dans l'hypothalamus latéral (LH), l'hypothalamus ventromédial (VMH) et le raphé, et augmente le rapport 5-HIAA / 5-HT dans le noyau paraventriculaire (PVN) et raphé [ 20 ]. Ces études ont montré que la DHEA et / ou son métabolite androstènedione peuvent à la fois augmenter ou diminuer la synthèse et le renouvellement de la 5-HT à différentes doses et dans différentes régions du cerveau. 5. Conclusion
Grâce à la présente enquête, nous avons montré un effet particulier de DHEAS sur l'activité sécrétoire du SCO dans le cadre des organes circonventriculaires. Ce dernier présentait une augmentation évidente du matériel de sécrétion réparti dans toutes les cellules SCO. Une telle augmentation de la libération de RF par les épendymocytes SCO peut impliquer un effet direct possible du neurostéroïde sur les épendymocytes de l'organe ou une modulation indirecte via le système sérotoninergique connu pour contrôler l'activité sécrétoire du SCO. La signification fonctionnelle d'une telle réaction n'est pas entièrement établie, bien qu'elle puisse être impliquée dans un éventuel rôle régulateur RF des niveaux de monoamines et / ou de métabolites dans le liquide céphalo-rachidien.
Cette recherche a été financée par une subvention de PROTARS III D14 / 71. Nous remercions également CNRST-Maroc, CNERS Maroc, la coopération Maroc-Tunisienne, IBRO, ISN et Neuromed pour leur soutien financier.